胆红素对烟雾损伤大鼠肺泡巨噬细胞的保护作用

转自    首席医学网      2007年10月12日 12:39:58 Friday  

作者：赵卉，李建强，刘卓拉，宋满景    作者单位：山西医科大学第二医院，山西 太原 030001

【摘要】  目的：探讨胆红素对烟雾损伤所致肺泡巨噬细胞(AM)的保护作用，寻求防治肺气肿发生、发展的新途径。方法：将健康Wistar大鼠36只，随机分为正常对照组、肺气肿模型组和胆红素干预组。模型组及干预组采用自制大鼠实验性被动吸烟装置熏烟，连续6个月。干预组在熏烟前予以间接胆红素灌胃；模型组和对照组予以生理盐水灌胃。3组动物自由饮食饮水，6个月后处死动物，取材检测；病理形态学检查；采用支气管肺泡灌洗技术收集AM并纯化培养。观察细胞培养液上清中MDA与MO含量。结果：光镜下对照组大鼠肺组织肺泡分布较均匀；模型组大鼠肺组织肺泡普遍扩张，扩张的肺泡融合成较大的囊腔；胆红素干预组肺组织肺泡部分有扩张；模型组与对照比较MDA、MO含量升高(P＜0.05)；干预组与模型组比较MDA、NO含量降低(P＜0.05)。结论：胆红素对于AM有一定的保护作用。

【关键词】  胆红素；肺泡巨噬细胞；保护

    The protective action of bilirubin on injuried alveolar macrophages of rats by smoke

    ZHAO Hui，LI Jianqiang，LIU Zhuola，SONG Manjing

    (The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

    Abstract Objective：To investigate the protective action of bilirubin on alveolar macrophage(AM) of pulmonary emphysema to explore a new method of prevention and cure of pulmonary emphysema.Methods：36 healthy Wister rats were divided into 3 groups at random：normal control group，pulmonary emphysema model group，bilirubin treated group.Rats in model group and treated group were exposed to cigarette smoke in a experimental device，six consecutive months.Rats in treated group were instilled  bilirubin before exposed to smoke；rats in mlodle group and control group were instilled the equal amount of physiological saline.All of the rats in three guoups were sacrificed to be tested after six months.Pathology were examined.Collect and culture AM of bronchoalveolar lavage fluid(BALF).The levels of MDA，nitricoxide(NO) in cultural supernatant liquid of AM were determined.Results：In model group，the changes of pathological observation were obvious；in treated group，the changes of all were obviously lighten.Model group vs.control group：the content of MDA，NO were increased(P＜0.05)；treated group vs.model group：the content of MDA，NO were decreased(P＜0.05).Conclusion：bilirubin exerts somewhat protection on AMs.

    Key words bilirubin；alveolar macrophage(Am)；protection

    肺泡巨噬细胞(AM)广泛分布于肺内及气道上皮内，是肺部免疫调节的核心细胞，在免疫防御、免疫清除、免疫调节、免疫损害等方面的作用越来越受到人们的关注。胆红素作为一种新型的抗氧化剂和免疫调节剂对某些组织具有保护作用［1，2］，但其对肺组织的作用报道甚少。

    本研究在大鼠肺气肿模型制作过程中，予以胆红素干预，纯化、培养支气管肺泡灌洗液(BALF)中AM，观察AM分泌的MDA及NO的变化，探讨胆红素对AM的保护作用。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料

    健康Wistar大鼠36只，体重150～200 g，雌雄不拘。随机分为正常对照组，肺气肿模型组，胆红素干预组。参照许三林等［3］自制大鼠实验性被动吸烟装置，模型组和干预组每日吸烟1次，每次燃烧10支卷烟，每支10 min，换烟时停止吸烟5 min。每周吸烟6 d，连续吸烟6个月。胆红素干预组在每日熏烟前给予间接胆红素灌胃20 mg·kg－1·d－1，每日1次。模型组和对照组分别予以生理盐水灌胃，方法同胆红素干预组。3组动物自由饮食饮水，于6个月末处死动物，取材检测。

    1.2 肺组织标本留取

    将大鼠予肝素(4000 U/kg)腹腔注射抗凝，5 min后用2％戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台上，放腹主动脉血处死动物。气管插管，完整取下心肺，向气管内灌注10％甲醛，直至肺膨胀，胸膜展平，边缘变锐，浸泡于10％甲醛中固定，取右下肺组织，常规石蜡包埋，切片。

    1.3 支气管肺泡灌洗及回收液的处理

    大鼠腹腔注射肝素(4000 U/kg)抗凝，5 min后腹腔注射20％戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，仰面固定于操作台，放腹主动脉血处死动物。分离气管，行气管插管并固定，用注射器注入37℃生理盐水，每次10 mL，注入后立即回收共10次，回收率90％，回收的BALF用双层无菌纱布过滤，经1500 r/min离心10 min，离心沉淀的细胞团用RPMI1640培养液重悬洗涤细胞2次，每次离心1200 r/min，6 min弃上清，再用含有10％新生小牛血清的RPMI1640培养液悬浮细胞，调整细胞浓度至每1×106/ mL～2×106/ mL中备用。

    1.4 肺泡巨噬细胞的纯化培养［4，5］

    将上述细胞悬液注入培养板中，放入37℃，50％CO2，饱和湿度的培养箱中，孵化2 h，PBS反复冲洗，除去未贴壁细胞，贴壁细胞即为纯化的肺泡巨噬细胞。用0.4％台盼兰排斥试验检查，存活率在95％以上者，继续放入上述条件培养箱中培养24 h后，回收培养液上清，置－70℃冰箱保存备用。

    1.5 MDA的测定

    将予留标本在室温下自然融化，用改良捌木氏法，722分光度仪检测MDA含量(nmol/L)。

    1.6 NO的检测

    将予留标本在室稳下自然融化。用硝酸还原酶法，严格按试剂盒说明书操作，设立空白管(0.1 mL双蒸水)、标准管(0.1 mL100 μmol/L KNO3)和测定管(0.1 mL样本)，依次加入1、2、3、4号试剂，混匀、静置、离心后取上清，加入显色剂显色，550 nm，0.5 cm光径比色测出吸光度值，运用公式计算出相应标本NO含量(μmol/L)。

    1.7 统计学处理

    结果以±s表示，两组均数间比较用LSD检验，两指标间用直线相关分析，检验水准取0.05。采用SPSS11.0版进行统计学分析。

    2 结  果

    2.1 病理改变

    光镜下肺组织病理改变：对照组，肺泡分布较均匀，间隔较完整，气管黏膜纤毛柱状上皮细胞排列整齐，周围炎性细胞较少。模型组，肺泡普遍扩张，间隔变窄，肺泡孔扩大，大量肺泡间隔断裂，扩张的肺泡融合成较大的囊腔，气管黏膜部分纤毛上皮细胞脱落，杯状细胞增生，管壁及周围有较多淋巴细胞等炎细胞浸润。胆红囊干预组，肺泡部分有扩张，部分肺泡间隔断裂，有囊腔形成气管黏膜纤毛柱状上皮细胞排列基本整齐，有少量杯状细胞，管壁及周围可见少量炎细胞浸润。

    2.2 MDA含量变化

    模型组MDA含量明显高于对照组(P＜0.05)，胆红素干预组MDA含量明显低于模型组(P＜0.05)，与对照组无统计学意义(P＞0.05)(见表1)。表1 三组大鼠AM培养液上清中MDA与NO含量

    2.3 NO含量变化

    模型组和胆红素干预组NO含量明显高于对照组(P＜0.05)。胆红素干预组NO含量低于模型组
(P＜0.05)(见表1)。

    3 讨  论

    本实验采用了大鼠被动性吸烟装置制造肺气肿模型。模型制作6个月后，从病理结果看，光镜下模型组肺泡普遍扩张，间隔变窄，肺泡孔扩大，大量肺泡间隔断裂，扩张的肺泡融合成较大的囊腔。气管管壁及周围有较多淋巴细胞等炎细胞浸润。符合肺气肿的病理改变。

    正常情况下，AM分布于呼吸道肺泡表面，是支气管肺泡灌洗液(BALF)中数量最多的细胞，占BALF细胞总数的80％以上。AM在支气管肺组织中的分布特点，决定了其为接触抗原最早，机会最多的细胞，组成肿组织的第一道防线。因此AM 在肺部疾患的发生发展中起重要的保护作用。

    传统认为胆红素是一种有害代谢产物。但STOCKER等［6］研究发现，胆红素是体内一种天然的抗氧化剂，可与超氧基因反应，降低机体氧化基团含量，发挥抗氧化作用。近年来一些研究也发现，在一定的浓度下，它是一种内源性强抗氧化剂，具有抗氧化、抗脂质过氧化、保护细胞免受伤害以及增强维生素C和E的抗氧化能力的作用［7，8］，因此，对看似健康人如果存在低胆红素血症，可能意味着他们罹患与氧自由基介导的脂质过氧化损害有关的疾病的危险性增加，目前对新生儿核黄疸已不再单一强调与血红胆素浓度有关，治疗也不再单纯一味地降低血胆红素浓度，而考虑到了胆红素对机体的保护性。本实验显示，模型组AM脂质过氧化的主要产物MDA含量高于对照组(P＜0.05)，表明可能是由于吸烟增加机体的氧化应激反应。SCHWERTNER［9］首先对此做了报道。胆红素干预组中MDA含量低于模型组(P＜0.05)，说明补充外源性胆红素能够有效提高体内胆红素水平，减轻氧化损伤，提高抗氧化能力。

    香烟烟雾中含有大量的氧自由基。长期的烟雾刺激，使下呼吸道自身修复和防御机能遭到破坏，病因得不到有效清除，导致正常状态被扰乱，为充血水肿的炎症所替代。炎症时，炎症介质可诱导AM单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA的表达及MCP1的分泌，促进血液中单核细胞在肺内聚集和活化，使肺内AM增多。已有研究证实，吸烟者AM数量增加且功能发生改变［10］。

    吸烟使下呼吸道局部主要的免疫细胞AM［11］发生脂质过氧化损伤而激活了AM，触发其释放大量的细胞因子调节和始动局部的免疫炎症性反应，从而在肺气肿形成过程中发挥作用，有报道，香烟烟雾可激活大鼠肺内NOS活性，并使之迅速上调，产生更多NO，NO是一种多功能分子，在呼吸系统的生理和病理过程中起重要作用。生理情况下，低剂量NO可能发挥细胞保护功能；高浓度的NO可诱发多种炎症性疾病，引起组织损伤［12］。本实验中，AM暴露于烟雾诱导iNOS的表达，从而产生大量NO，模型组AM培养液上清含量与对照组比较增高(P＜0.05)。应用了胆红素这一抗氧化剂后，AM培养液上清中NO减少(P＜0.05)，进一步说明了胆红素的抗氧化性对AM具有保护作用。

【参考文献】
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